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新闻中心

半定量RT-PCR和定量RT-PCR的区别

发布时间:2020-05-11浏览次数:358返回列表

    定量PCR较半定量准确,可实时定量。理论上有1个copy的差别就能区分开。如果你只想看看大致趋势,半定量不失为一种快速的方法。现在一些高级别的刊物上还有半定量的结果,如plant cell, plant physiology, genome biology等。

    半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitatie reerse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术,较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法geng为简便可行。这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。



    步骤,1。抽提RNA,2。反转录获得cDNA,3。以cDNA为模板做PCR!

    注意:步骤1,RNA抽提极速快三一定要好,注意污染。内参的选择,常用的有βactin和GAPDH俩中。步骤3,半定量RT-PCR应该再两管中进行,既内参和目的基因各一管,这样便于控制,做图的时候可以放在一各泳道里跑!指数期和平台期一定要摸清楚!

    定量RT-PCR(quantitatie reerse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR)是在用一步法或两步法,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。有相对定量和绝dui定量两种分析方法,绝dui定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。另外,与传统的PCR技术相比,Real-time Q-PCR的不足之处是:

(1)由于运用了封闭的检测,减少了扩增后电泳的检测步骤,因此也就不能监测扩增产物的大小;(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性,从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力;

(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高,从而也限制了其广泛的应用。