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公司名称:上海古朵生物科技有限公司

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新闻中心

古朵生物提供基因合成定制服务!

发布时间:2020-05-21浏览次数:360返回列表

    客户提供

    基因序列或蛋白质氨基酸序列

    zui终交付

    约4 μg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA;

    含有重组质粒的穿刺菌一管;

    发货文件主要包括如下内容:测序结果、COA报告、sqd文件。

    备注:默认合成克隆基因至pUC57载体

    郑重承诺:对客户提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的结果没有所有权,并承诺对结果严格保密,且不会以任何形式散布到第三方。

    载体选择主要考虑下述3点:

    1、构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

    2、载体的类型:

    (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。尤其对于病毒载体来说,载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。

    ①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前,我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。

    ②慢病毒的包装容量约为6kb(包含载体带有的其他抗性基因或报告基因),但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了,增大1kb会下降1个单位数量级的滴度,故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外,毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白(作为受体、转运蛋白行使功能)等由于其本身的功能,包装可能会有一定难度。

    ③AAV的总包装容量是4.7 kb(包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb),所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限,目的基因大于2kb,可考虑去除内含子,因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。

    (2)确定表达蛋白的目的,然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒,前者主要用于体外纯化蛋白,如带His-tag的PET系列,带GST-Tag的PGEX系列,选用不同的表达载体,就得建立相应的纯化系统,包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等,还得考虑目的蛋白的可溶性,一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些,如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用,只需要将它放到细胞或体内细胞即可,唯1考虑的是它的启动子的选择,常用都是cmv启动子的,表达效率较高,也有多种启动子经过改造的表达载体,一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。

    3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于连接,不产生阅读框架错位。

    ①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);

    ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个;

    ③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

    ④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因。