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新闻中心

三代测序技术已经应用这么普遍了?

发布时间:2020-07-01浏览次数:51返回列表

三代测序技术兴起已经不是一天两天的事情,可是好多小伙伴对它的认知好像仅仅限于一个名词,没有具体去深入了解过,以为可能就是跟现在的二代测序技术没有什么差别,只是升级版而已,小编很负责任的告诉你,在你不知道的时间里,它已经成为科研领域不可或缺的一种主流技术,广泛应用于基因组Denovo、全长转录本检测、宏基因组、重测序和变异检测等多个方向,并且在染色体结构变异(SV)的检测中有着不可替代的优势。

特别是随着近两年 eccDNA(extrachromosomal circular DNA)即染色体外环状DNA成为科研界的宠儿,三代测序技术geng是被推上了浪潮的尖端。

第三代测序技术主要有两大技术:

第1是单分子实时荧光测序,脱氧核苷酸用荧光标记,显微镜可以实时记录荧光的强度;当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候,它的荧光就同时在DNA链上被探测到;当它与DNA链形成化学键的时候,它的荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失。这种荧光标记的脱氧核酸不会影响DNA聚合酶的活性,并且在荧光被切除之后,合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

优点:

(1)可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间,来检测一些碱基修饰情况,即如果碱基存在修饰,则通过聚合酶时的速度会减慢,相邻两峰之间的距离增大,可以通过这个来直接检测甲基化等信息

(2)测序速度很快,每秒约10 个dNTP

(3)读长长(约50kb):超长读长可获得mRNA全长序列及完整结构信息,提高拼接效率,转录本无需拼接;克服无参考基因组物种转录本拼接短、信息不完整的难题;实现有参考基因组物种研究可变剪切及融合基因等结构变异。精-准重构转录组/基因组全貌

(4)直接对原始DNA/RNA样本测序,无需PCR扩增,无GC偏好性

(5)需要的样品量很少,样品制备时间花费少

缺点:

(1)测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病),达到15%

好在它的出错是随机的,并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向,因而可以通过多次测序来进行有效的纠错

(2)依赖DNA聚合酶的活性

(3)成本比二代测序较高

第二是纳米孔测序,新型纳米孔测序法(nanopore sequencing)是采用电泳技术,借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的;由于纳米孔的直径非常小,仅允许单个核苷酸聚合物通过,而ATCG单个碱基的带电性质不一样,通过电信号的变化差异就能检测出通过的碱基类别,从而实现测序。

优点:

(1) 测序读长:大约在几十kb,甚至100 kb,理论上只要DNA分子不断开就可以一直通过纳米孔(比如很火的eccDNA,往往比较大,并且往往携带多个染色质来源的序列,因此仅用二代测序很难完整构建出eccDNA的全长序列。三代测序技术显著提高了测序中分子读长的问题,可以用于eccDNA的全长序列鉴定)

(2) 可以直接读取甲基化的胞嘧啶,不必像二代测序那样需要对基因组进行bisulfite处理(怎么理解:也就是用三代测序做一个全基因组测序的话,可以同时有DNA甲基化的数据分析)

(3) 测序通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);

(4) 起始DNA在测序过程中不被破坏;

(5) 以及样品制备简单又便宜

缺点:

(1) 测序准确率:Nanopore测序准确率和Pacbio持平,为86%左右。而且起始位置正确率偏低,在大约100nt位置达到稳定,且错误为随机测序错误。如果是对DNA正负链都进行测序,可以达到96%的准确率

(2) 切断的核苷酸可能被读错方